bg_image

نکات ساده برای افزایش حساسیت در آنالیزهای U\HPLC:

 

هدف اصلی هر آنالیز U/HPLC دستیابی به حساسیت بهینه است. در اینجا به 5 اقدام و ترفند ساده که به راحتی قابل اجرا هستند، اشاره شده است.

1. ملاحظات فاز متحرک:

حلال با گرید مناسب را انتخاب کنید. حلال هایی که “به اندازه کافی تمیز” نیستند سیگنال پس زمینه بالایی می دهند. چندین گرید حلال برای HPLC موجود است، به عنوان مثال “گرید HPLC”، “گرید LC-MS” یا “گرید UHPLC-MS”. گریدحلال را طوری انتخاب کنید که با نیازهای روش آنالیزی شما مطابقت داشته باشد. بررسی برگه مشخصات یا گواهی آنالیز حلال کمک می کند تا تصمیم بگیرید که کدام یک مناسب تر است.

برای جلوگیری از سرکوب یون در LC-MS، باید فقط از بافرهای فاز متحرک فرار با خلوص بالا و افزودنی هایی مانند آمونیوم فرمات، استات یا تری اتیل آمین آنهم در غلظت های متوسط استفاده شود.

مطمئن شوید که این معرف ها دارای گرید MS هستند. همچنین، از آنجایی که پلی اتیلن گلیکول (PEG) معمولا به عنوان آلاینده در LC-MS شناسایی می شود، حلالی را پیدا کنید که دارای مشخصات PEG باشد، مانند حلال های درجه LiChrosolv® UHPLC-MS، که در آنها سطح PEG در هر بچ تولید شده کنترل می شود.

هنگام استفاده از آشکارساز UV در طول موج های کمتر از 210 نانومتر، استونیتریل را به جای متانول انتخاب کنید، زیرا استونیتریل دارای طول موج کات آف کمتری است (190 نانومتر).

2- ملاحظات زمان تعادل:

در روش‌های فاز معکوس، از اجرای زمان‌های تعادل طولانی با فاز متحرک دارای درصد بالای آب، اجتناب کنید، زیرا این امر منجر به تجمع آلاینده‌ها در سر ستون می‌شود.

در متودهای های گرادیانی، این آلاینده‌ها در زمان‌های بازداری خاصی شسته می‌شوند و حساسیت را به خطر می‌اندازند یا حتی پیک‌های مزاحم ایجاد می‌کنند.

شکل زیر نشان می دهد که هم نویز پس زمینه و هم ارتفاع پیک آلاینده با افزایش زمان تعادل افزایش می یابد.

در فاز معکوس، شستشوی دوره ای ستون با 10 حجم ستون توسط حلال 100 درصد آلی، مانند استونیتریل، برای حذف هر گونه آلاینده ای که ایجاد شده است، روش خوبی است.

3- ملاحظات ستون HPLC:

از ستونهای با قطر داخلی کوچک استفاده کنید. با کاهش قطر داخلی ستون، سیگنال به نویز افزایش یافته و حساسیت بهبود می یابد. از ستون با اندازه ذرات کوچک استفاده کنید. اگر محدودیت های فشار سیستم LC اجازه می دهد، از ستون های ذرات کوچکتر استفاده کنید. ذرات کوچکتر راندمان جداسازی بهتری فراهم می کنند.

از ستونهای با ذرات متخلخل سطحی (SPP) استفاده کنید. SPP ها رزلوشن و کارایی بالایی را بدون نیاز به تحمل فشارهای برگشتی بالا ارائه می دهند.

از ستون های یکپارچه (Monolithic) استفاده کنید. چراکه جداسازی سریع را در فشار برگشتی کم امکان پذیر می کنند.

4- ملاحظات دستگاه:

از حجم های مرده (dead volume) جلوگیری کنید. راه اندازی مناسب خود سیستم HPLC می تواند به افزایش حساسیت کمک کند. به حداقل رساندن حجم مرده بسیار مهم است. به عنوان مثال، حجم تمام قطعات سیستم از انژکتور تا سلول آشکارساز.

حجم‌های مرده بزرگ می‌توانند باعث پهن شدن پیک ها، دنباله دار شدن یا شکافتن آنها شوند و در نتیجه منجر به رزلوشن ضعیف و کاهش عملکرد شوند. و در نتیجه منجر به حساسیت های کمتر و عدم امکان شناسایی آنالیت های با غلظت پایین می شود.

در نتیجه، تمام قطعات سیستم (لوله، اتصالات و غیره) باید به حداقل رساندن حجم های مرده کمک کنند.

5- ملاحظات نمونه:

هنگام کار با ماتریس های پیچیده، استفاده از استخراج فاز جامد (SPE) به حذف گروه های اصلی آلاینده مانند پروتئین ها و نمک ها کمک می کند.

از جاذب های گزینش پذیر برای ماتریس های خاص استفاده کنید برای مثال از جاذب HybridSPE مبتنی بر زیرکونیا برای حذف فسفولیپیدها و پروتئین ها در پلاسما یا سرم استفاده کنید.

تجهیزات سنجش تام

پیشرو در آنالیز دستگاهی